冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)顯示了嵌入在玻璃化薄冰中的大分子的原子結構，它們接近于原生狀態(tài)。然而，作為確保高圖像質量的關鍵因素，冰厚的均勻性在樣品制備過程中控制得很差，這已成為高分辨率冷凍電鏡的主要挑戰(zhàn)之一。
2022年12月15日，北京大學彭海琳，韋小丁，清華大學王宏偉及劉楠共同通訊在Nature Methods 在線發(fā)表題為“Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)薄冰的均勻性依賴于支撐膜的表面平整度，并開發(fā)了一種使用超厚石墨烯(UFG)作為支撐進行冷凍電鏡標本制備的方法，以實現(xiàn)更好地控制玻璃冰厚度。
該研究發(fā)現(xiàn)UFG上均勻的薄冰提高了玻璃化標本的圖像質量。利用這種方法，該研究成功地測定了血紅蛋白(64 kDa)、不對稱的α胎蛋白(67 kDa)和鏈霉親和素(52 kDa)的三維結構，分辨率分別為3.5 ?、2.6 ?和2.2 ?。此外，該研究結果證明了UFG在冷凍電子斷層掃描和基于結構的藥物發(fā)現(xiàn)領域的潛力。
冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)已成為結構生物學的主要工具。隨著冷凍電子顯微鏡分辨率的提高，生產高分辨率結構測定所需的均勻薄冰變得越來越重要。對于分子量小于100 kDa的小生物分子，冷凍電子顯微鏡的低對比度阻礙了成功的重建，并降低了能夠實現(xiàn)的分辨率，因為高分辨率的結構確定需要薄冰來最小化背景噪聲。
在冷凍電鏡樣品制備中制備薄冰的標準過程中，通常通過從支撐膜中抽干多余的溶液來獲得薄液體膜。最近發(fā)現(xiàn)，抽干過程中液固界面的粗糙和不均勻是生產可重復和均勻冰厚的基本限制。1990年，人們發(fā)現(xiàn)薄膜的均勻性和厚度顯著地受到下方支撐的粗糙度的影響。即液膜越薄，支撐粗糙度的作用越明顯。因此，均勻薄的玻璃冰的生產似乎依賴于超厚支撐膜的發(fā)展。
據(jù)研究人員所知，支撐膜的表面平整度與冰厚均勻性之間的關系還不甚清楚，用于薄冰沉積的超厚支撐膜還沒有被創(chuàng)造出來。即使在薄的氧化石墨烯納米片和生長在銅箔上的石墨烯薄膜上，密集的靜態(tài)皺紋(褶皺和波紋)也是不可避免的，盡管這兩者已被證明有助于更好的冷凍電鏡樣品制備。褶皺表面的高度差可達數(shù)十納米，并將直接塑造冰的形狀，導致冰的厚度不均勻，數(shù)據(jù)收集區(qū)域的顆粒高度分布也不盡相同。此外，皺面在高傾斜角度下會產生明顯的強噪聲，成為應用于冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)時的一個嚴重問題。
石墨烯粗糙度決定了冰厚的均勻性（圖源自Nature Methods ）
該研究提出了一種無褶皺的預拉伸超厚石墨烯(UFG)，用于均勻薄冰制備，其中目標顆粒被吸附在UFG表面的同一平面上，這將它們與空氣-水界面隔離。在UFG制備的樣品的+60°至- 60°傾斜過程中，該研究沒有觀察到通常在傳統(tǒng)粗糙石墨烯膜中出現(xiàn)的任何波紋特征。使用UFG，該研究獲得了血紅蛋白(64 kDa)在3.5 ?分辨率的重建，α胎蛋白(67 kDa)在2.6 ?分辨率的重建，鏈菌親和素(52 kDa)在2.2 ?分辨率的重建，這使得在原子級分辨率的結構細節(jié)可視化。
此外，UFG可以與功能配體提供平坦均勻的相互作用表面，從而實現(xiàn)更可控的生物活性功能化，以實現(xiàn)對目標生物分子的高親和力和生物友好性識別。除了在原子分辨率EM成像中的應用外，UFG的設計還可以推廣到其他二維材料，進一步擴展到藥物發(fā)現(xiàn)、高性能電子器件和分離膜的應用。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01693-y
